Selain dari adanya pengaruh kebudayaan hal yang paling signifikan dari efek kehadiran Portugis adalah gangguan dan disorganisasi perdagangan Asia namun di samping itu adalah adanya penyebaran Agama Kristen di Indonesia Timur termasuk Maluku. Portugis yang telah menaklukkan Malaka pada awal abad keenambelas dan pengaruh mereka terasa sangat kuat di Maluku dan kawasan lain di timur Indonesia. Setelah penaklukan Portugis atas Malaka pada bulan Agustus 1511, Afonso de Albuquerque pelajari rute ke Kepulauan Banda dan Kpulauan Rempah-Rempah lainnya dengan mengirim sebuah penjelajahan tiga kapal ekspedisi di bawah pimpinan António de Abreu, Simao Afonso Bisigudo dan Francisco Serrano. Di tengah perjalanan untuk kembali, Francisco Serrao yang terdampar di pulau Hitu (Ambon utara) pada 1512. Ia mendirikan hubungan dengan penguasa lokal yang terkesan dengan kemampuan militer. Adanya pertikaian antara Kerajaan Ternate dan Tidore juga melibatkan Portugis.
Setelah bergabung dengan Ternate, Serrão kemudian membangun benteng di pulau tersebut dan menjadi kepala duitan dari para serdadu Portugis di bawah pelayanan satu dari dua sultan yang berkuasa mengendalikan perdagangan rempah-rempah. Namun dengan adanya penyebaran agama Kristen mengakibatkan terjadinya ketegangan dengan Penguasa Ternate yang adalah Muslim. Ferdinand Magellan Serrão mendesak dia untuk bergabung di Maluku dan memberikan informasi para penjelajah tentang Kepulauan rempah-rempah. Akan tetapi, keduanya meninggal sebelum sempat bertemu satu sama lain. Pada tahun 1535 Raja Tabariji diberhentikan dan dikirim ke Goa oleh Portugis. Ia kemudaun menganut Kristen serta mengubah namanya menjadi Dom Manuel. Setelah dinyatakan bersalah, dia dikirim kembali ke takhtanya kembali, tetapi meninggal dalam perjalanan di Melaka pada 1545. Meskipun begitu, ia mewariskan pulau Ambon kepada Ayah Baptisnya yang adalah seorang Portugis, Jordão de Freitas. Setelah kejadian pembunuhan Sultan Hairun oleh Portugis, Ternate keudian mengusir mereka pada tahun 1575 setelah pengepungan selama 5 tahun.
Pendaratan Portugis yang pertama di Ambon terjadi pada tahun 1513, yang di kemudian hari akan menjadi pusat kegiatan Portugal di Maluku setelah pengusiran dari Ternate. Kekuatan Eropa di daerah tersebut pada saat itu lemah dan Ternate makin menyebarkan kekuasaannya sebagai Kerajaan Islam anti Portugis di bawah pimpinan Sultan Baab Ullah dan anaknya Sultan Said. Di Ambon, Portugis mendapat perlawanan dari penduduk muslim lokal di daerah utara pulau tesebut terutama di Hitu yang telah lama menjalin hubungan kerjasama perdagangan dan agama dengan kota-kota pelabuhan di pantai utara Jawa.Sesungguhnya, Portugis tidak pernah berhasil mengendalikan perdagangan rempah-rempah lokal dan gagal dalam upaya untuk membangun otoritas mereka atas kepulauan Banda, pusat produksi pala.
Spanyol kemudian mengambil kontrol atas Ternate dan Tidore. Misionaris dan saah satu dari Orang Suci Katolik, Santo Fransiscus Xaverius (Saint Francis Xavier), tiba di Maluku pada tahun 1546-1547 kepada orang Ambon, Ternate, dan Morotai serta meletakkan dasar untuk misi permanen di sana. Dengan tibanya beliau di sana, 10.000 orang telah dibaptis menjadi Katolik, dengan persentase terbanyak di pulau Ambon dan sekitar tahun 1590 terdapat 50.000 bahkan 60.000 orang telah dibaptis, walaupun beberapa daerah sekitarnya tetap menjadi daerah Muslim.
Selama pekerjaan Misionaris, telah terdapat komunitas Kristen dalam jumlah besar di daerah timur Indonesia selama beberapa waktu, serta telah berkontribusi terhadap kepentingan bersama dengan Eropa, khususnya di antara orang Ambon. Pengaruh lainnya termasuk sejumlah besar kata berasal dari Indonesia Portugis yang di samping Melayu merupakan bahasa pergaulan sampai awal abad kesembilanbelas. Kata-kata dalam Bahasa Indonesia seperti pesta, sabun, bendera, meja, Minggu, semua berasal dari bahasa Portugis. Banyak pula nama-nama keluarga di Maluku berasal dari Portugis seperti de Lima, Waas, da Costa, Dias, de Fretas, Gonsalves, Mendosa, Rodrigues, dan da Silva.
